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紫杉醇与顺铂结合应用对人胃癌SGC7901细胞的感化

时间:2019-06-24    点击: 次    来源:搜集转载    作者:佚名kmteckels.com - 小 + 大年夜

紫杉醇与顺铂结合应用对人胃癌sgc7901细胞的感化

【关键词】  pa;cddp;体外研究;胃癌

【摘要】  目标 研究紫杉醇 (pa) 结合顺铂 (cddp) 对人胃癌sgc7901细胞株的影响。办法 采取mtt法检测两种药物单用和结合应用对细胞的感化,光镜和电镜不雅察细胞构造的变更,流式细胞仪检测sgc7901细胞周期分布及端粒酶的活性。成果 pa可克制sgc7901细胞的发展,且呈剂量及时间依附性(p<0.05);光学显微镜下可见经 pa和cddp培养的胃癌细胞核周存在异常物质,电镜下在细胞内可见异常致密物;pa对人胚肺成纤维细胞(hpf)发展起促进感化,且呈剂量依附性(p<0.05);pa与 cddp结合应用对sgc7901细胞发展的克制具有协同感化(p<0.05);同时克制端粒酶活性。结论 pa对胃癌sgc7901细胞有克制造用,雷同剂量对正常细胞无克制造用。pa与cddp对胃癌细胞的克制具有协同感化,与单用cddp比拟,pa与cddp结合应用可增添cddp的用药剂量。

【关键词】  pa;cddp;体外研究;胃癌

 【abstract】 objective to evaluate the effect of combination of paclitaxel (pa) and cisplatin (cddp) on the human gastric carcinoma cell sgc7901 in vitro. methods effects of pa and cddp were measured by mtt assay, and the interaction between these two agents was evaluated by the isobologram technique of berenbaum. cellular morphology was observed by phasecontrast, light microscope and electron microscope. flow cytometry was used for sgc7901 cell cycle analysis and measure telomerase. results pa significantly inhibited the growth of sgc7901 cell in a dose and timedependent way (p<0.05). numerous abnormal particles were found around the nucleus of sgc7901 cell under phasecontrast microscope, and also many materials in cytoplasm were found under light microscope, and also many dense materials in cytoplasm were found under electron microscope. pa significantly stimulated the growth of human embryonal pulmonary fibroblast (hpf) dose dependently (p<0.05). a strong synergism was found between pa and cddp in sgc7901 cells. pa induced g0/g1phase arrest but without statistical significance, and cddp significantly induced sphase arrest (p<0.05) in sgc7901 cells, and inhibited telomerase activity. conclusions pa can inhibit cell growth in gastric carcinoma cells but not in normal cells. pa and cddp have synergetic effect on the inhibition of gastric carcinoma cells. the combination of cddp and pa can reduce the cddp dose.

  【key words】 paclitaxel; cisplatin; in vitro; gastric cancer

  胃癌的病发率和恶性程度比较高,胃癌轻易产生转移,个中人胃癌sgc7901细胞对多种化疗药物敏感。www.relunwen.cOm我国胃癌术后5年总生计率仍缺乏40%〔1〕。紫杉醇(pa)具有独特的抗癌机制和奇异的抗癌功能,被誉为近30年来天然抗癌药物研究范畴最严重年夜的发明〔2,3〕。本研究以人胃癌sgc7901细胞株为研究对象,不雅察了pa对胃癌细胞及正常人体细胞的感化,并进一步研究pa与惯例化疗药物顺铂(cddp)结合应用对胃癌细胞感化的影响。

  1 材料与办法

  1.1 材料、试剂和仪器

  人胃癌sgc7901细胞、hpf由中国医学迷信院供给,cddp由山东齐鲁制药厂临盆,pa、碘化丙啶(pi)、rnase a、胎牛血清均购自sigma公司,rpmi1640培养基购自 gibco/brl公司,mtt由上海华舜生物工程无限公司临盆, 全主动酶标仪为 multis ascent 公司产品,超纯水仪系purelab plus公司产品,流式细胞仪系facs calibur公司产品。

  1.2 细胞培养

  惯例清醒人胃癌sgc7901细胞,按贴壁办法培养,细胞培养在经过0.22 μm滤膜过滤的rpmi1640培养液中(含10%热灭活胎牛血清,0.2%nahco3,青霉素100 u/ml和链霉素100 μg/ml),培养条件为37℃、5%的co2、饱和湿度。用pbs配制的0.15%的胰蛋白酶(含有0.02%的edta)消化细胞传代,每周传代1~2 次,搜集指数生经久sgc7901细胞用于实验研究。hpf细胞培养同上。

  1.3 单用pa对sgc7901和hpf细胞的感化

  将浓度为5×104个/ml sgc7901细胞接种于8块96孔板,每孔200 μl,每种细胞设 3个复孔,37℃,5%的co2培养箱内培养。逐日取一块培养板,弃培养液,参加无血清培养液180 μl,每孔参加mtt(5 g/l)20 μl,持续培养4 h,终止培养,弃培养液,参加二甲基亚砜150 μl,振荡5 min,以空白孔调零,用全主动酶标仪测定570 nm光接收值。浓度为横坐标,细胞克制率为纵坐标,绘制细胞发展曲线。选用 2、4、6、8、16、20 μg/ml 6个浓度的pa分别对sgc7901细胞和hpf细胞停止培养,pa用照应的培养液配制。对比组用含0.1%无水乙醇的培养液培养。培养24、48、72 h先行mtt检测,实验反复3次,成果取均匀值。计算细胞增殖克制率(%)=1-实验组均匀od值/对比组均匀od值×100%和折半克制浓度(ic50)〔4〕。

  1.4 cddp单用对sgc7901细胞的感化

  选用 0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/ml 7个浓度的 cddp培养sgc7901细胞,cddp用照应的rpmi1640培养液配制,对比组用照应rpmi1640培养液培养。细胞浓度、培养办法、克制率和 ic50的计算同1.3。

  1.5 pa与 cddp结合应用对sgc7901 的感化

  根据pa和cddp伶仃用药成果,得出两种药物的ic50值。采取序贯用药方法,起首用 ic50以下浓度为1、2、4、6、8、16、20 μg/ml的pa培养液分别培养sgc7901细胞 24 h,弃去培养液。然后换用 ic50以下浓度为0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/ml的 cddp持续培养24 h后终止感化,停止检测,计算 ic50值,对比组不含pa。pa拔取1、2、4、6、8、16、20 μg/ml 7个浓度,计算48 h的 ic50值。cddp拔取0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/ml 7个浓度,计算48 h的ic50值,归并指数=结适用药达到折半克制浓度时甲用药量/甲单用时达到折半克制浓度的用量+结适用药达到折半克制浓度时乙用药量/乙单用时达到折半克制浓度的用量。归并指数<0.95时表示两种药物有协同感化,归并指数>1.05 时两种药物有拮抗感化,0.96<归并指数<1.04时两种药物有相加感化〔5〕。

  1.6 细胞形状学不雅察

  1.6.1 光镜不雅察

  设立pa组、cddp组、pa+cddp组,用pbs配制的0.15%的胰蛋白酶(含有0.02%的edta)消化细胞,制成5×104个/ml单细胞悬液接种于内铺小玻璃片的24孔培养板内,置于37℃,5% co2培养箱内培养48 h 后用0.1 mol/l pbs洗濯2 次,室温枯燥,中性树胶封片处理,光镜下不雅察、摄影。

  1.6.2 透射电镜不雅察

  设立pa组、cddp组、pa+cddp组,sgc7901细胞在 100 ml培养瓶中贴壁后,参加处理药物,于 48 h终止反响,用 pbs液洗濯,悄悄用细胞刮将细胞刮下,离心后4%戊二醛固定 2 h以上,0.1 mol/l pbs (ph 7.2)冲刷,持续用20 mg/g的四氧化锇固定,脱水、包埋、切片和染色按惯例处理,透射电镜(em208s,芬兰)不雅察、摄影。

  1.7 流式细胞仪(fcm)分析细胞周期分布

  细胞在 100 ml培养瓶中贴壁后,用含 0.5%胎牛血清 rpmi1640处理 24 h,使细胞同步于g0/g1期。换用含 10%胎牛血清培养液,参加不合浓度的处理药物,感化 48 h终止反响,pa+cddp组:sgc7901细胞于 pa感化 24 h后换用 cddp感化 至48 h终止反响,搜集 1 ×106个细胞,用 pbs液洗濯,置于 4℃预冷乙醇 (70%) 中固定 12 h以上。rnase a处理细胞 30 min(37℃),参加 pi溶液,每管样品检测10 000个细胞,实验反复2次,成果取均匀值,上机检测细胞周期分布。

  1.8 端粒酶〔

  6〕活性测定 用无血清的rpmi1640培养液分别处理细胞0、12、24、36、48、60、72 h后,使细胞同步化后分组。a组:用不含血清的rpmi1640培养液作为对比;b组:参加含pa的无血清rpmi1640培养液,0、12、24、36、48、60、72 h后按telomerase试剂盒解释书标准法式榜样停止检测。于570 nm波长下检测吸光度(a)值,并计算端粒酶的相对活性(%)。

  1.9 统计学处理

  采取sas统计软件包停止t考验。

  2 结 果

  2.1 pa对sgc7901细胞发展的影响

  设立pa 共6个浓度对sgc7901细胞的发展均具有克制造用,且克制率随药物浓度的降低和感化时间的延长而增长(p<0.05),感化24、48和72 h后的ic50值分别是1.8、5.1和5.9 μg/ml。在低浓度、24 h内对肿瘤细胞发展开端有克制造用(见图1)。图1 pa对sgc7901细胞发展克制曲线

  2.2 pa对 hpf细胞发展的影响

  设立 pa共 6个浓度,均对 hpf细胞发展起促进感化,且hpf细胞存活率随药物浓度的降低而增长(p<0.05),但与感化时间无明显关系(p<0.05)(见图2)。图2 pa对hpf细胞发展促进曲线

  2.3 cddp对sgc7901细胞发展的影响

  设立 cddp 共7个浓度,对sgc7901细胞的发展均具有明显的克制造用,克制率随药物浓度的降低和感化时间的延长而增长(p<0.05) (见图3)。感化 24、48和 72 h后的ic50值分别是 0.21、0.35、0.44 μg/ml。

  2.4 pa和cddp结适用药对sgc7901细胞发展的影响

  pa拔取1、2、4、6、8、16、20 μg/ml 7个浓度,处理48 h后的 ic50值为2.1 μg/ml(见图4)。cddp拔取0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/ml 7个浓度,处理48 h后的ic50值为0.15 μg/ml(见图5)。归并用药后与伶仃用药比较,细胞克制率明显增长,所应用的药物剂量在增添,2.1 μg/ml pa+0.15 μg/ml cddp的细胞克制率明显增长。pa伶仃应用处理48 h后ic50图3 cddp对sgc7901细胞发展克制曲线图4 pa和cddp结合应用对sgc7901细胞发展克制影响是 5.1 μg/ml,cddp伶仃应用处理48 h后ic50是0.35 μg/ml;归并用药后,pa应用量处理48 h后ic50是2.1 μg/ml,cddp应用量处理48 h后ic50是0.15 μg/ml。归并指数是 0.83,提示2.1 μg/ml pa+0.15 μg/ml cddp结适用药有协同感化。

  2.5 光镜不雅察细胞形状学成果

  光镜下sgc7901细胞呈单层分列,细胞大年夜小不一,为多角形,sgc7901细胞界线清楚,核大年夜,圆形,结适用药组呈细胞逝世亡景象,细胞界线不清,细胞变圆,细胞核染色深,细胞质可见大年夜量颗粒 (见图5)。

  2.6 电镜不雅察细胞形状学成果

  透射电镜下sgc7901细胞开端为正常状况,细胞质丰富,核仁多个,界线清楚,外面微绒毛丰富,结适用药组呈细胞逝世亡景象,细胞界线不清,细胞变圆,细胞核染色深,细胞质可见大年夜量颗粒(见图6)。

  2.7 细胞周期检测成果

  对比组比拟,单用pa和单用cddp对细胞增殖周期没有明显影响。pa和cddp适用对细胞增殖周期中的g2/m期有明显影响(p<0.05),提示细胞阻滞在s期,使sgc7901细胞的有丝决裂遭到克制,使肿瘤细胞数量增添,从而克制细胞的发展 (见表1)。

  2.8 药物对端粒酶活性的影响

  设立pa组、cddp组、pa+cddp组,药物感化于sgc7901细胞0、12、24、36、48、60、72 h后,发明随时间的延长,则各组端粒体酶活性在逐步降低,然则结适用药与伶仃用药 对端粒酶活性的影响不明显(见图7)。图5 sgc7901细胞形状学光镜下不雅察成果(×200)图6 sgc7901细胞形状学电镜不雅察(×10 000)表1 pa与ddp适用前后 sgc7901细胞周期图7 pa、cddp、pa+cddp分别感化于sgc7901细胞后端粒体酶活性变更

  3 讨 论

  胃癌是我国罕见的恶性肿瘤,其逝世亡率居各类恶性肿瘤之首,且多半患者为停顿期胃癌。结合化疗为其治疗的重要手段,但疗效差。这重要与化疗筹划有密切关系。同时化疗对机体的毒副感化,比如骨髓克制、免疫克制、胃肠道反响等也是不言而喻的。很多患者由于耐受不了而放弃治疗,更有一些身材状况不佳的患者因化疗而加快逝世亡。是以必须寻求新的药物配伍筹划。pa已成为以后世界上最热点、最滞销、最紧缺、最昂贵和临床上广泛应用的广谱抗癌药物。近年来,国表里文献均有报导pa对多种恶性肿瘤的产生、生长有克制造用。cddp也不例外,也是今朝常常应用的抗肿瘤药物。本研究将pa和cddp结合应用以期增添抗癌药物的用量〔6,7〕。

  本研究成果提示两种药物可以配伍,并且还具有协同感化,同时参加pa的rpmi1640培养液对 hpf停止了培养,成果发明 pa对该细胞的感化不是克制而是其促进发展,提示pa在克制肿瘤细胞的同时对正常人体细胞并没有克制造用,在人体应用相对安然〔8〕。本研究还对pa的感化机制做了初步商量,发明 pa感化是将细胞阻滞于g0/g1期,提示 pa可以克制细胞进入有丝决裂周期。经 cddp培养的细胞重要被阻滞于s期,使开端增殖的细胞没法停止决裂,提示 cddp也能够克制细胞有丝决裂,二者适用可以在细胞周期的两个阶段对细胞停止克制,说清楚明了二者协同的缘由;最后发明结适用药随时间的延长,则端粒酶活性也逐步降低,然则结适用药与伶仃用药对端粒酶活性的影响不明显,这也提示检测两种药物结合应用对肿瘤细胞的研究成果时,mtt法检测两种药物单用和结合应用对细胞的感化、光镜和电镜不雅察细胞构造的变更、流式细胞仪检测sgc7901细胞周期分布与检测端粒酶活性比拟较要明白。

  综上所述,本研究证明pa对胃癌细胞株sgc7901具有克制造用,对人体正常细胞hpf无克制造用。pa与化疗药物cddp在克制肿瘤细胞方面具有协同感化,cddp的应用可增添pa的用量。这为胃癌的新综合治疗筹划供给了实际根据,然则否能应用于临床另有待于进一步研究。

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